中国是食管癌高发国家，食管癌的发病和死亡病例占全球一半，其中约90%为食管鳞状细胞癌（ESCC）。放化疗（chemoradiotherapy， CRT）在ESCC的综合治疗中起着关键作用，新辅放化疗（nCRT）可提高早中期ESCC的R0切除率，延长患者生存时间，但其病理完全缓解（pCR）率仅为26-49%。因此，寻找能够准确预测nCRT疗效的生物标志物迫在眉睫^[1-4]。

浙江省肿瘤医院陈奇勋教授、苏丹教授、裘国勤教授团队与威尼斯9499登录入口合作，通过全外显子测序（WES）和转录组测序（RNA-seq）对57例ESCC患者治疗前后的样本进行检测分析发现：①nCRT可重塑ESCC基因变异图谱和转录图谱；②治疗后获得性插入缺失百分比更高，提示更佳的肿瘤病理缓解、无复发生存（RFS）和总生存（OS）。相关研究成果已发表在放射肿瘤学顶级期刊International Journal of Radiation Oncology · Biology · Physics（IF=7.0）^[5]。

该论文第一作者为杨洋副主任医师和冯婷婷副主任医师。

研究亮点

1、研究揭示了与nCRT病理缓解相关的基线基因组特征，DDR或HIPPO信号通路缺陷的患者对nCRT治疗更敏感。

2、通过探究nCRT对基因变异图谱、转录图谱的重塑发现：基因变异方面，nCRT可诱导产生插入缺失、再现性局部缺失(recurrent focal deletion)；而转录组层面，细胞增殖相关基因表达水平下调，细胞粘附相关基因表达水平上调。

3、结合患者临床和预后信息证实，获得性插入缺失百分比可提示nCRT疗效。

研究内容

研究采集了57例ESCC患者nCRT治疗前后样本，共137例样本质控合格。其中82例样本（54例治疗前样本、28例治疗后样本）进行了WES测序，55例样本（26例治疗前样本、29例治疗后样本）进行了RNA-seq测序。通过对比pCR和non-pCR患者基因组特征，分析治疗前后基因变异图谱和转录图谱的变化，来探究nCRT的疗效预测标志物，以及nCRT对ESCC基因变异图谱和转录图谱的影响，并通过GLASS（the Glioma Longitudinal Analysis）cohort对研究结果作进一步验证。验证队列纳入90例接受放疗的胶质瘤患者，对患者的基线和首次复发样本进行WES测序，突变和拷贝数变异数据可及。

研究结果

研究首先对比了pCR和non-pCR组基线样本的基因变异图谱，受限于样本量，并未发现单个基因的突变频率在两组间存在统计学差异。但进一步分析发现，pCR组中DDR和HIPPO信号通路基因的突变频率显著更高（p=0.02）。为了探讨DDR和HIPPO通路缺陷程度与nCRT治疗响应之间的关系，研究依据DDR和HIPPO通路基因的变异情况，将患者划分为三个变异等级：0级（DDR和HIPPO通路基因无变异）；1级（仅一条信号通路的基因发生突变或杂合性缺失）；2级（发生更多变异，如突变和杂合性缺失同时发生或两条通路基因均出现变异等）（图1A）。研究发现，随着变异等级的升高，pCR率显著提升（p=0.0002，图1B），且肿瘤退缩等级（TRG）达到1-2级的患者更多（图1C）。这些数据提示，DDR或HIPPO通路的缺陷可能会使患者对nCRT更敏感，且这种敏感性与缺陷程度相关。此外研究还发现，基线样本中致癌基因突变数量更多、12q24.31深度扩增频率更高，与较差的病理缓解相关（图1D、E、F）。

图1. 与nCRT治疗响应相关的基线基因变异特征

nCRT后，总体肿瘤突变负荷（TMB）下降，表明nCRT清除了一定数量的基线突变。但研究同时观察到，小片段插入缺失的百分比在nCRT后上升。这一现象的产生是由于nCRT清除了更多的SNVs（单核苷酸突变），还是诱导产生了更多的小片段插入缺失？研究对比了nCRT治疗前所有突变、治疗前特有突变（仅在nCRT治疗前样本中检出，即被nCRT清除的突变）、治疗后所有突变、治疗后特有突变（仅在nCRT治疗后样本中检出，即nCRT治疗期间获得突变）发现，插入缺失仅在治疗后特有突变中占比更高（图2A）。这一结果提示，nCRT诱导产生了更多的插入缺失。

染色体不稳定性方面，治疗后的样本中，再现性局部缺失明显增多（图2B）。为了系统研究nCRT治疗前后，染色体不稳定性的变化，研究利用CNApp在线工具作进一步分析，探究获得性插入缺失与治疗后拷贝数变异的关系。如图3所示，获得性插入缺失百分比与局部拷贝数缺失（focal CANs loss，FCS loss）呈正相关（Spearman ρ=0.52，p=0.005），而与广泛拷贝数扩增（broad CNAs gain，BCS gain）呈负相关（Spearman ρ=−0.61，p=0.0006，FDR=0.003）。

图2. nCRT治疗前后基因变异图谱的比较

图3. 获得性插入缺失百分比与治疗后拷贝数变异相关性分析

基于nCRT诱导产生插入缺失的结论，研究提出猜想，获得性插入缺失百分比可以提示nCRT的疗效。为了证实这一猜想，研究结合获得性插入缺失百分比和患者的预后数据进行分析。结果显示，获得性插入缺失百分比较高的患者，其RFS（图4A）和OS（图4B）获益更佳，多因素分析同样具有统计学意义（图4C、D）。此外，随着TRG等级增加，获得性插入缺失百分比呈下降趋势（p=0.06）（图4E）。上述结论在验证队列GLASS cohort中同样得到了证实。

图4. 获得性插入缺失百分比提示nCRT疗效

RNA测序分析显示，nCRT治疗后细胞增殖相关基因表达下调，细胞粘附相关基因表达上调（图5A）。且DNA复制相关基因的表达水平随着TRG等级的增加呈上升趋势（p=0.03）（图5B）。与此同时，DNA复制相关基因的高表达也与较差的RFS和OS有关（图5C、D）。因此，DNA复制相关基因的高表达，与患者较差的治疗响应和预后有关。

图5. nCRT重塑转录图谱以及转录图谱变化与预后的关系

结语

本研究通过WES测序和RNA-seq测序对57例ESCC患者治疗前后的样本进行检测分析，鉴定了与nCRT病理完全缓解相关的信号通路和分子特征，描绘了nCRT诱导的基因变异图谱和转录图谱变化，并进一步证明了获得性插入缺失百分比可以作为疗效生物标志物，为ESCC的个体化诊疗提供了潜在治疗靶点和新型生物标志物。

参考文献