导   语

肺胎儿型腺癌 (FLAC) 是一种罕见的肺腺癌，根据其临床病理特征和生物学行为，FLAC可进一步分为高级别胎儿腺癌 (H-FLAC) 和低级别胎儿腺癌 (L-FLAC)。L-FLAC确诊时分期一般较早，预后良好；而H-FLAC确诊时通常处于晚期，预后不及L-FLAC和普通肺腺癌。目前，针对FLAC的研究基本来自病例报道，FLAC的分子特征，尤其是其表观遗传和转录组学特征仍需进一步明确。

近日，中国医学科学院肿瘤医院林琳教授、应建明教授团队，通过威尼斯9499登录入口多组学检测平台，对20例FLAC患者的多区域样本进行全外显子测序、DNA靶向甲基化测序及全转录组测序，发现H-FLAC和L-FLAC在多组学景观上存在差异，并且这两个亚型还表现出多层面瘤内异质性（ITH）差异，且不同类型的ITH对患者预后影响不同。相关研究成果发表于Nature子刊npj Precision Oncology（IF=7.9）。

研究方法

研究共纳入20例FLAC患者，包括12例H-FLAC和8例L-FLAC。每位患者获取肿瘤边缘经组织病理学确认的正常组织，以及对应FFPE上3个相隔至少0.3厘米的肿瘤区域样本。对所有患者共计60份肿瘤组织和20份正常组织样本进行全外显子测序（WES）和靶向甲基化检测，同时再对其中6例患者共18份肿瘤组织和6份正常组织样本进行Bulk RNA-Seq检测（图1）。通过对比不同亚型FLAC患者的基因突变谱、甲基化模式以及转录表达差异，深入了解FLAC分子特征和多组学景观。

图1. 研究线路图

研究结果

FLAC患者突变图谱特征显示，TP53基因的突变频率最高，尤其在H-FLAC中（图2a）。所有FLAC患者的平均肿瘤突变负荷（mTMB）为2.6mut/MB，其中H-FLAC患者为3.6 mut/MB，略高于L-FLAC患者的1.3 mut/MB（图2b）。与东亚肺腺癌队列（EAS-LUAD）相比，FLAC患者的EGFR基因突变频率显著更低（图2c）。突变特征分析表明，与年龄相关的SBS1和SBS5特征在FLAC患者中富集（图2d）。与L-FLAC相比，H-FLAC中与烟草相关的SBS4和DBS2更加富集，而与DNA错配修复缺陷相关的SBS6和DBS10在L-FLAC中更富集。GISTIC 2.0分析显示，不同亚型的FLAC在拷贝数变异（CNV）的基因上存在差异（图2e）。

图2. FLAC患者基因组景观和突变特征。

a: FLAC患者基因突变图谱特征；b: H-FLAC与L-FLAC亚型肿瘤突变负荷比较；c: FLAC与东亚肺腺癌队列基因突变频率对比；d: FLAC患者COSMIC突变特征分布；e: H-FLAC和L-FLAC亚型的体细胞拷贝数变异。

通过分析个体间的甲基化和基因表达数据，无监督t-SNE分析和层次聚类结果显示，同一肿瘤的不同区域通常聚集在一起（图3a、b），但H-FLAC和L-FALC样本在甲基化或基因表达上均未单独聚类（图3a、b）。通过与正常组织样本对比，进一步研究H-FLAC和L-FLAC的表观遗传和转录组学特征（图3c、d）。差异表达基因（DEG）分析显示，H-FLAC和L-FLAC中与细胞周期相关的基因均上调，而细胞黏附、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路和钙信号通路均下调（图3d）。H-FLAC的差异化甲基化区域（DMR）和DEG分析显示，与神经活性配体-受体相互作用相关的基因显著低甲基化，与DNA复制、错配修复和细胞周期相关的基因上调。在L-FLAC中，RAS信号通路高甲基化。但通过DEG分析发现钙信号通路下调，而DMR分析却发现钙信号通路低甲基化。总体而言，DMR和DEG的通路富集分析显示，H-FLAC和L-FLAC在表观基因组景观上存在显著差异，但在转录组景观上彼此相似。

图3. FLAC患者DNA甲基化与基因表达模式。

a: 基于甲基化数据的无监督t-SNE分析结果；b: 基于全转录组数据的无监督t-SNE分析结果；c: FLAC患者基于差异甲基化区域的通路富集结果；d: FLAC患者基于差异表达基因的通路富集结果。

为了研究FLAC患者的基因遗传、表观遗传和转录异质性，研究分别对患者的体细胞突变、甲基化数据和基因表达数据进行系统发育树分析。通过计算评估得到突变ITH、CNV ITH、甲基化ITH和转录ITH，以量化每个肿瘤内的异质性程度（图4a）。结果发现，H-FLAC的体细胞突变和CNV ITH评分显著低于L-FLAC（图4b）。然而，两个亚型间在甲基化ITH和转录ITH方面没有显著差异。在H-FLAC和L-FLAC亚型中，突变ITH和CNV ITH均显示出正相关性（图4c、d），这表明基因异质性的一致性。在L-FLAC中，基因ITH与表观遗传ITH和转录ITH显著正相关。然而，在H-FLAC中，尽管甲基化ITH与转录ITH呈正相关，但突变ITH和CNV ITH与转录ITH却显示出显著的负相关性，这表明H-FLAC具有相反的基因异质性和转录异质性。

进一步研究ITH指标与患者生存的相关性发现，相比H-FLAC，L-FLAC具有更高的基因ITH（图4b），表现出显著更长的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）。而后根据突变、CNV或甲基化ITH的中位数将患者分为高和低ITH组，并分析ITH与生存之间的关系。结果显示，具有高突变ITH的患者OS和RFS显著更长（图4e），高CNV ITH的患者OS和RFS有所改善（图4f）。Cox多因素回归分析显示，在调整了分期和病理分类后，突变ITH水平仍是一个显著的预后因素。然而，甲基化ITH却无法提示患者的生存获益情况。

图4. FLAC中多层面瘤内异质性对比及对生存的影响。

a: 患者基于基因突变、拷贝数变异、甲基化水平以及基因表达水平的ITH分布情况；b: H-FLAC和L-FLAC亚型间基因突变、拷贝数变异、甲基化水平以及基因表达水平的ITH比较；c, d: H-FLAC（图c）和L-FLAC（图d）中基因突变、拷贝数变异、甲基化水平以及基因表达水平与ITH的相关性；e: 高基因突变ITH患者OS及RFS均更长；f：高拷贝数ITH患者OS及RFS均较长。

结   语

本研究通过威尼斯9499登录入口多组学检测平台，深入分析了罕见肺胎儿型腺癌（FLAC）的多组学特征，绘制了其基因组、表观基因组和转录组的详细图谱。通过多区域取样，揭示了不同FLAC亚型在基因变异、表观遗传和转录组层面的瘤内异质性（ITH），并发现这些不同层面的ITH与患者的无复发生存期和总生存期存在关联。该研究为理解FLAC及其亚型的基因组多样性、表观遗传调控机制和转录调控网络提供了新的视角，同时为临床治疗策略的制定提供了重要参考。

参考文献